Характеристика антибиотических резистомов с помощью репрограммированного бактериофага

Природная микробиология, том 8, страницы 410–423 (2023 г.) Процитировать эту статью

10 тысяч доступов

79 Альтметрика

Подробности о метриках

Функциональная метагеномика является мощным экспериментальным инструментом для выявления генов устойчивости к антибиотикам (ARG) в окружающей среде, но диапазон подходящих видов бактерий-хозяев ограничен. Это ограничение влияет как на объем выявленных ARG, так и на интерпретацию их клинической значимости. Здесь мы представляем конвейер функциональной метагеномики под названием «Многовидовая функциональная метагеномика с использованием перепрограммированных бактериофаговых частиц» (DEEPMINE). Этот подход сочетает и улучшает использование бактериофага Т7 с замененными хвостовыми волокнами и целевого мутагенеза для расширения специфичности и эффективности фага-хозяина для функциональной метагеномики. Эти модифицированные фаговые частицы были использованы для введения больших библиотек метагеномных плазмид в клинически значимые бактериальные патогены. Путем скрининга ARG в микробиомах почвы и кишечника, а также клинических геномах на предмет 13 антибиотиков мы демонстрируем, что этот подход существенно расширяет список идентифицированных ARG. Многие ARG оказывают видоспецифическое влияние на устойчивость; они обеспечивают высокий уровень устойчивости у одного вида бактерий, но дают очень ограниченную устойчивость у родственного вида. Наконец, мы идентифицировали мобильные ARG против антибиотиков, которые в настоящее время находятся в стадии клинической разработки или недавно были одобрены. В целом, DEEPMINE расширяет набор инструментов функциональной метагеномики для изучения микробных сообществ.

Метагеномика позволяет провести исчерпывающий анализ микробных сообществ, включая виды, которые невозможно культивировать в лабораторных условиях. Извлекая геномные данные из образцов окружающей среды, исследователи получают знания о видовом составе и функциях микробиома в различных природных средах1. В частности, функциональная метагеномика занимается скринингом метагеномной ДНК на наличие генов, кодирующих специфические молекулярные функции2,3,4. Клонирование и экспрессия фрагментированной метагеномной ДНК в бактериальном хозяине может выявить ранее неописанные белки. Приложения функциональной метагеномики включают идентификацию ферментов, исследование биологически активных агентов и скрининг генов устойчивости к антибиотикам, находящихся в окружающей среде5,6,7,8. Библиотеки обычно содержат миллионы фрагментов ДНК, общий объем которых составляет 5–100 Гб, что соответствует размеру тысяч бактериальных геномов7,9,10.

Хотя функциональная метагеномика потенциально может быть полезна для нескольких областей исследований, в ее нынешнем виде методология далека от совершенства, что ограничивает ее применимость. Учитывая огромный размер плазмидных библиотек, центральное значение имеет эффективное введение этих библиотек в бактериального хозяина. Однако этот процесс – обычно путем электропорации, конъюгации или традиционной трансдукции бактериофага – является громоздким и эффективен только для ограниченного диапазона лабораторных штаммов11,12. Это ограничение имеет далеко идущие последствия для применимости функционального метагеномного скрининга и общности выводов, которые можно сделать13,14. Например, это препятствует скринингу биотехнологически или клинически значимых генов, которые функциональны только у определенных видов бактерий 12,15,16. В частности, большинство метагеномных скринингов генов устойчивости к антибиотикам (ARG) в значительной степени основаны на использовании лабораторных штаммов Escherichia coli в качестве бактерий-хозяев5,17,18. Таким образом, ARG, которые не обеспечивают устойчивость у этих штаммов, но обеспечивают ее у других клинически значимых патогенов, остаются необнаружимыми. Действительно, предыдущие исследования показывают, что влияние мутаций устойчивости к антибиотикам на фенотипы устойчивости зависит от генетического фона бактерии-хозяина19. Кроме того, метагеномный скрининг множества бактерий-хозяев может предоставить ценную информацию о межвидовой функциональной совместимости и мобильности ARG20.

В этой статье мы представляем многовидовую функциональную метагеномику с использованием перепрограммированных бактериофаговых частиц (DEEPMINE), которая обеспечивает решение этих проблем (рис. 1а). DEEPMINE основан на предыдущей работе, целью которой было расширить круг хозяев фаговых частиц Т7 для трансдукции ДНК путем обмена хвостами между различными типами бактериофагов21. DEEPMINE использует такие модифицированные частицы, трансдуцирующие бактериофаги, для доставки больших библиотек метагеномных плазмид к ряду видов бактерий. Кроме того, мы применили направленную лабораторную эволюцию для повышения эффективности доставки такой библиотеки22. Используя этот подход, мы провели метагеномный скрининг клинически значимых бактериальных патогенов семейства Enterobacteriaceae. Мы идентифицировали несколько ранее не зарегистрированных ARG с видоспецифичным действием на чувствительность к антибиотикам. Кроме того, мы изучили ряд антибиотиков, которые только недавно были одобрены для клинического применения или находятся на поздней стадии клинической разработки, и показали, что эти новые антибиотики так же склонны к формированию резистентности, как и старые антибиотики, после десятилетий клинического применения (расширенные данные). Таблица 1).